Reactividad de sueros de ratones inmunizados con vesículas de membrana externa derivadas de Salmonella entérica / Reactivity of sera from mice immunized with outer membrane vesicles derived from Salmonella enterica

La fiebre tifoidea causada por Salmonella Paratyphi A (fiebre paratifoidea) es indistinguible de la producida por Salmonella Typhi y el grado de incidencia ha aumentado en los últimos años, especialmente en el sudeste asiático. Por otro lado, la diarrea y otras complicaciones entéricas causadas por Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium continúan siendo un problema de salud grave, especialmente en países subdesarrollados. Las vacunas continúan siendo la forma más efectiva de prevenir estas enfermedades. Existen vacunas basadas en el polisacárido capsular de Salmonella Typhi que protegen contra la fiebre tifoidea; sin embargo, no hay vacunas efectivas licenciadas para uso en humanos que prevengan las enfermedades producidas por los serotipos de Salmonella no tifoideas. El desarrollo de una formulación con capacidad para proteger contra estas enfermedades sigue siendo un desafío para la comunidad científica. En este trabajo se evaluó, mediante Western blot, la reactividad de los sueros de ratones inmunizados por vía subcutánea con formulaciones basadas en vesículas de membrana externa derivadas de Salmonella Paratyphi A, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, contra los respectivos lisados celulares, para identificar la formulación que induce la mejor respuesta inmunológica cruzada. Los resultados obtenidos indicaron una alta reactividad de todos los sueros a los lisados, sin una diferencia aparente entre ellos. Sin lugar a dudas, se deberán realizar pruebas de inmunogenicidad seguidas de pruebas de retos cruzados para identificar un candidato vacunal. Estos resultados sugieren que las vesículas de membrana externa empleadas en este estudio están compuestas por antígenos posiblemente conservados en los tres serotipos de Salmonella y que pueden inducir una respuesta inmune de amplio espectro y protección cruzada(AU)

Typhoid fever caused by Salmonella Paratyphi A (paratyphoid fever) is indistinguishable from that caused by Salmonella Typhi and the degree of incidence has increased in recent years, especially in Southeast Asia. On the other hand, diarrhea and other enteric complications caused by Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium continue to be a serious health problem, especially in underdeveloped countries. Vaccines continue to be the most effective way to prevent these diseases. There are vaccines based on Salmonella Typhi capsular polysaccharide, which protects against typhoid fever; however, there are no effective vaccines licensed for use in humans to prevent disease caused by nontyphoidal Salmonella serotypes. Developing a formulation capable of protecting against these diseases remains a challenge for the scientific community. In this work, the reactivity of the sera of mice immunized subcutaneously with formulations based on Outer Membrane Vesicles (OMV) derived from Salmonella Paratyphi A, Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium, was evaluated by Western blot, against the respective cell lysates to identify the formulation that induces the best cross immune response. The results obtained indicated a high reactivity of all the sera to the lysates; without an apparent difference between them. Undoubtedly, immunogenicity tests followed by cross-challenge tests should be performed to identify a vaccine candidate. These results suggest that the OMV used in this study are composed of possibly conserved antigens in the three Salmonella serotypes and that they can induce a broad-spectrum immune response and cross protection(AU)

Estudio de consistencia de un cultivo en zaranda de Streptococcus pneumoniae 19A a escala de 40 L / Study of the consistency of a culture on of Streptococcus pneumoniae 19A on rotational shaker at a scale of 40 L

Streptococcus pneumoniae es un patógeno oportunista que puede causar infecciones como otitis media, neumonía, sepsis y meningitis. Sin embargo, existen muchas limitaciones para el cultivo en zaranda de este microorganismo en los laboratorios de microbiología. Por esta razón, se realizó un estudio de la consistencia del cultivo en zaranda de Streptoccoccus pneumoniae 19A a escala de 40 L. Para esto se desarrolló previamente la curva de crecimiento patrón hasta las 5 h. Desde el pre-inóculo se inocularon 6 frascos de 100 mL, de los cuales se realizó la inoculación en botellones de 1 L y 5 L. En todos los casos, se determinó la pureza a partir de la tinción de Gram y el crecimiento bacteriano se monitoreó por el método de conteo de viables y la densidad óptica cada 1 h. Además, se evaluó el rendimiento del cultivo a partir de la cantidad de biomasa obtenida por peso húmedo. Cada proceso se llevó a cabo en condiciones iguales por triplicado. En los tres procesos se obtuvieron curvas de crecimiento similares, tanto por densidad óptica como por conteo de viables, alcanzando una viabilidad máxima de 109 UFC/mL en la última escala. Además, se obtuvieron rendimientos de biomasa de 11,62; 11,92 y 11,60 g/L, respectivamente. Estos resultados demuestran que la metodología utilizada ofrece una consistencia de este proceso, a pesar del alto volumen de cultivo en zaranda, lo cual no afectó la calidad de la biomasa, demostrado por la viabilidad final(AU)

Streptococcus pneumoniae is an opportunistic pathogen that can cause infections including otitis media, pneumonia, sepsis and meningitis. However, there are many limitations for the cultivation in shaker of this microorganism in microbiology laboratories. For this reason, a study of the consistency of the culture in shaker of Streptoccoccus pneumoniae 19A was carried out at a scale of 40 L. The pattern growth curve was made until 5 h, under our laboratory conditions and culture medium. From the pre-inoculum 6 bottles of 100 mL were inoculated, from which the scaling was accomplished to bottles of 1 L and 5 L. In all cases the purity was determined by Gram staining and the bacterial growth by viable counting method and the optical density were monitored every 1 h. In addition, the yield was evaluated from the determination of the amount of biomass obtained by wet weight. Each process has been made in equal conditions in triplicate. In the three processes, similar growth curves were obtained both by optical density and by viable counts, reaching a maximum viability of 109 CFU/mL on the last scale. In addition, biomass yields of 11.62, 11.92 and 11.60 g/L were obtained, respectively. These results demonstrate that the methodology used offers a high process consistency, despite the high volume of culture in rotational shaker, and did not affect the quality of the biomass, which could be demonstrated by the viable count(AU)

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R² =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R² =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R2 =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R2 =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Caracterización proteómica de vesículas de membrana externa extraídas de Shigella sonnei / Proteomic characterisation of outer membrane vesicle extracted from Shigella sonnei

Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VMEs) previenen de manera exitosa la enfermedad meningocócica del serogrupo B. Esta plataforma tecnológica de obtención puede ser aplicada para otros patógenos bacterianos Gram negativos. Una vacuna de VMEs desarrollada contra Shigella sonnei fue obtenida a través de una extracción de componentes celulares y su caracterización por electroforesis en geles de poliacrilamida unidimensional (1D). Se estudiaron las mejores condiciones de solubilización de las muestras, separación electroforética e identificación a través de espectrometría de masas acoplada a cromatografía de alta presión después del corte de las bandas y su tratamiento enzimático con tripsina. En esta etapa se identificaron un total de 57 proteínas en 23 bandas (2,5 proteínas por banda escindida), 47 de las proteínas no repetidas. Las proteínas inmunogénicas presentes en VMEs de S. sonnei fueron cuantificadas en cuanto a masa molecular por 1D-Western blotting en membranas de nitrocelulosa con anticuerpos obtenidos a partir de ratones inmunizados con las VMEs. Como que las bandas electroforéticas 1D contenían más de una proteína, se estudiaron las mejores condiciones de separación por el método de electroforesis bidimensional (2D) para el establecimiento del mapa proteico; tal que el incremento del tamaño de las tiras, el tiempo de focalización y la aplicación catódica garantizaron la mayor resolución(AU)

Outer membrane vesicles (OMVs) vaccines successfully prevent Group B meningococcal disease. This platform technology may be applied against other Gram negative bacterial pathogens. An OMV vaccine against Shigella sonnei was prepared by detergent extraction of cells and characterised by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (1D). The protein components were quantified by staining and scanning and the composition of bands were defined by coupled high-performance low chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry after band excision and in-gel trypsin digestion. 57 proteins contained in 23 bands (2.5 proteins/split band) were detected, 47 of them were not repeated. The S. sonnei OMVs immunogenic proteins were identified by 1D-immunoblotting, after transfer of proteins to a nitrocellulose membrane and treatment with antibodies generated by immunisation of mice with the OMVs. The bands detected by 1D had more than a single proteins, that is why we studied the best conditions for molecular separation by two-dimension electrophoresis (2D) for establishing the protein map; such that the increase of strips size, time of isoelectric focusing (IEF) and cup-cathodic loading guaranteed the highest resolution(AU)

Caracterización proteómica de vesículas de membrana externa extraídas de Shigella sonnei / Proteomic characterisation of outer membrane vesicle extracted from Shigella sonnei

Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VMEs) previenen de manera exitosa la enfermedad meningocócica del serogrupo B. Esta plataforma tecnológica de obtención puede ser aplicada para otros patógenos bacterianos Gram negativos. Una vacuna de VMEs desarrollada contra Shigella sonnei fue obtenida a través de una extracción de componentes celulares y su caracterización por electroforesis en geles de poliacrilamida unidimensional (1D). Se estudiaron las mejores condiciones de solubilización de las muestras, separación electroforética e identificación a través de espectrometría de masas acoplada a cromatografía de alta presión después del corte de las bandas y su tratamiento enzimático con tripsina. En esta etapa se identificaron un total de 57 proteínas en 23 bandas (2,5 proteínas por banda escindida), 47 de las proteínas no repetidas. Las proteínas inmunogénicas presentes en VMEs de S. sonnei fueron cuantificadas en cuanto a masa molecular por 1D-Western blotting en membranas de nitrocelulosa con anticuerpos obtenidos a partir de ratones inmunizados con las VMEs. Como que las bandas electroforéticas 1D contenían más de una proteína, se estudiaron las mejores condiciones de separación por el método de electroforesis bidimensional (2D) para el establecimiento del mapa proteico; tal que el incremento del tamaño de las tiras, el tiempo de focalización y la aplicación catódica garantizaron la mayor resolución(AU)

Outer membrane vesicles (OMVs) vaccines successfully prevent Group B meningococcal disease. This platform technology may be applied against other Gram negative bacterial pathogens. An OMV vaccine against Shigella sonnei was prepared by detergent extraction of cells and characterised by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (1D). The protein components were quantified by staining and scanning and the composition of bands were defined by coupled high-performance low chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry after band excision and in-gel trypsin digestion. 57 proteins contained in 23 bands (2.5 proteins/split band) were detected, 47 of them were not repeated. The S. sonnei OMVs immunogenic proteins were identified by 1D-immunoblotting, after transfer of proteins to a nitrocellulose membrane and treatment with antibodies generated by immunisation of mice with the OMVs. The bands detected by 1D had more than a single proteins, that is why we studied the best conditions for molecular separation by two-dimension electrophoresis (2D) for establishing the protein map; such that the increase of strips size, time of isoelectric focusing (IEF) and cup-cathodic loading guaranteed the highest resolution(AU)